免疫遺伝子INHBAは関節症における軟骨損傷と関連し、TGF-β/p38 MAPK経路の時間的活性化を仲介する可能性がある：マルチオミクス・機械学習・実験的検証の統合 ｜安心・安全な『キチン chitin 甲壳素関連総合メーカー』なら甲陽ケミカル株式会社

要旨：
本研究は、関節症（OA）関連の免疫遺伝子のスクリーニングおよび同定、これらの遺伝子により仲介される主要シグナル伝達経路の時間的活性化の基礎となるメカニズムの解明、ならびに潜在的な治療化合物のスクリーニングを行い、OAの精密診断および標的介入のための理論的基盤を提供することを目的としている。
筆者らは遺伝子発現バンク（GEO）データベースから正常対照群（NC）を伴う4セットのOA軟骨トランスクリプトミクスデータセットをダウンロードし、バッチ補正後に訓練セットおよび2つの独立した検証セットを構築して免疫関連の差異的に発現する遺伝子（Immune-DEGs）をスクリーニングした一方で、12の基本的な機械学習アルゴリズムに基づいて113の複合モデルを構築し、10分割交差検証により最適化したうえで検証セットで評価することにより重要な免疫遺伝子を同定した。
その後、筆者らは機能的豊富化分析を実施して豊富化されたシグナル伝達経路を明らかにするとともに、Shapley加法説明（SHAP）分析および加重遺伝子共発現ネットワーク分析（WGCNA）を統合することで中心的な免疫遺伝子を特定し、さらに単一細胞擬似時間分析を用いてOA進行中のそれらの動的発現パターンを解読した。
加えて、筆者らは実時間定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）およびウエスタンブロット分析を用いて細胞モデルおよび異なる病変重症度のOA動物軟骨組織における中心遺伝子および主要経路タンパク質の発現変化を検証し、DSigDBデータベースを用いた薬の再利用によって潜在的な治療化合物をスクリーニングするとともに、分子ドッキングおよび分子動力学シミュレーションにより臨床で一般的に使用される医薬品の中心的な標的に対する結合能を検証した。
その結果、筆者らはOAと有意に関連する12の免疫関連DEGをスクリーニングしたほか、10の重要な免疫遺伝子に基づくOA分類モデルを構築し、本研究の限定的なサンプルにおいて良好な分類能を示したことが報告された。
また、機能的豊富化分析により、これらの重要な免疫遺伝子がTGF-β信号伝達経路に有意に豊富化されていることが明らかになり、SHAP分析とWGCNA分析を統合した結果、INHBAがOAと関連する主要なハブ遺伝子として同定された。
単一細胞擬似時間分析によって、OA進行に伴いINHBA発現が持続的にアップレギュレートされることが示唆されたほか、in vitroおよびin vivo実験検証により、ヒト軟骨細胞およびラット軟骨組織におけるINHBA mRNA値はOA病変の悪化に伴い継続的に増加することが報告された。
ウエスタンブロット分析の結果は、総TGF-β1タンパク質が最初に増加してからその後減少する時間的変化を示す一方で、INHBAおよび下流のリン酸化p38 MAPKタンパク質値は疾患進行中に継続的に上昇し、これらの知見からTGF-β経路とp38 MAPK経路間の時間的活性化スイッチの存在が示唆された。
薬の再利用により、プロゲステロンを含む10の潜在的な治療化合物が同定されたほか、分子ドッキング分析によってジクロフェナク、セレコキシブ、グルコサミン、およびコンドロイチン硫酸が中心的な標的に安定的に結合できることが示されたものの、分子動力学シミュレーションはセレコキシブとINHBAタンパク質間の安定的な結合形態をさらに確認した。
本研究は、10の重要な免疫遺伝子に基づくOA分類モデルを成功裏に構築し、中心的な免疫遺伝子INHBAがOA進行と強く関連しており、TGF-β/p38 MAPK経路の時間的活性化を仲介することでOAにおける軟骨変性に寄与する可能性があることを実証している。